在生物技术领域，蛋白质定向进化技术作为一项关键工具，通过模拟自然进化过程，能够快速优化蛋白质功能，这为生物技术的诸多应用场景提供了可能性。然而，传统的定向进化方法如易错 PCR 等存在效率低下、耗时较长以及突变库多样性受限等问题。

近年来，基于 CRISPR-Cas 或 T7 RNA 聚合酶的突变系统虽取得了一定进展，但仍面临突变范围局限、宿主兼容性较差等挑战，尤其在非模式生物中，缺乏高效的蛋白质定向进化工具，极大地限制了其在工业生物技术领域的广泛应用。

【SynBioCon】获悉，在此背景下，清华大学陈国强教授团队成功开发出一种新型正交转录突变系统（OTM），用于加速体内蛋白质进化。相关文章以题为“An orthogonal transcription mutation system generating all transition mutations for accelerated protein evolution in vivo”发表在 Nature Communications 期刊。

该系统巧妙地融合了三种广宿主兼容性的噬菌体 RNA 聚合酶（MmP1、K1F、VP4）以及两种脱氨酶（PmCDA1 和 TadA 变体），构建了一个高效且模块化的蛋白质进化平台。其核心原理在于，RNA 聚合酶在转录过程中能够解旋 DNA 形成单链区，而与之融合的脱氨酶则可对暴露的单链 DNA 进行编辑，实现 C:G-T:A 和 A:T-G:C 类型的碱基突变。这一创新设计使得蛋白质的定向进化过程在短短 1 天内即可完成，突变效率相较于自发突变提升了 150 万倍。

研究团队通过采用 XTEN 柔性连接肽分别将胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶与噬菌体 RNA 聚合酶进行融合，成功构造了能够产生特定类型碱基突变的正交转录突变元件。同时，通过引入尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）并对诱导条件进行优化，实现了突变效率的显著提升。此外，研究人员还通过合理组合两种脱氨酶与噬菌体 RNA 聚合酶，构建了能够同时引入两种突变的双功能正交转录突变元件，进一步提升了系统的功能性和效率。

在实验中，研究人员在目标基因上下游分别插入噬菌体启动子，成功实现了突变在目标基因上的均匀分布，有效解决了以往单个启动子策略中突变偏向启动子近端的问题。正交性实验结果表明，基于不同噬菌体 RNA 聚合酶的正交转录突变元件能够特异性地识别各自的启动子，避免了交叉干扰，为后续的模块化设计提供了可能性。尤为重要的是，该系统在非模式生物（如嗜盐单胞菌 Halomonas bluephagenesis）和模式生物（如大肠杆菌 E.coli）中均展现出了优异的性能，有效解决了现有工具在非模式生物中效率低下的难题。

在应用层面，该系统展现出了巨大的潜力。研究人员通过突变荧光蛋白和色素蛋白，成功培育出了具有多种不同颜色的细胞；通过靶向突变细胞骨架和分裂相关蛋白，获得了多种形状独特的工程菌株，为形态学工程改造提供了新的思路；在工业应用场景下，通过一轮突变进化 σ⁷⁰ 全局转录调控因子 RpoD 和赖氨酸外排蛋白 LysE，成功获得了能够增强 L - 精氨酸耐受性和转运能力的突变体。

图 |  正交转录突变系统的设计、开发、优化和应用

总的来说，正交转录突变系统凭借其高突变效率、高特异性和低脱靶率的优势，在实际进化过程中仅用 1 天即可完成以往需要数周才能实现的蛋白质优化过程。该系统在模式和非模式生物中均展现出色的性能，有效解决了现有工具在非模式工业菌株中应用受限的问题。

展望未来，该技术具有广阔的拓展空间和应用前景。一方面，可以尝试整合其他突变类型的脱氨酶，进一步丰富突变库的多样性；另一方面，可以探索该系统在其他非模式生物中的兼容性和适用性。在应用层面，该突变系统有望在加速生物制造（如 PHA 生产）中关键酶的优化方面发挥重要作用，推动绿色生物经济的发展。

清华大学生命科学学院陈国强教授为该论文的通讯作者，生命学院 2022 级博士生邵明威为第一作者。其他作者包括陈国强实验室的科研助理张忠楠、博士后金晓帆和 2023 级博士生丁军。该研究得到了国家自然科学基金和清华北大生命联合中心的基金支持。