SynBio团队 | 郑裕国院士团队汤晓玲、柳志强

L -蛋氨酸作为人体必需氨基酸，在饲料、医药、食品等领域具有不可替代的作用，其高效生物合成一直是生物技术领域的研究热点。课题组前期成功建立起发酵-酶法合成L-蛋氨酸的技术路线，通过高效细胞工厂构建，发酵生产前体氧琥珀酰L-高丝氨酸（OSH），耦联O -琥珀酰- L -高丝氨酸巯基转移酶（MetZ），实现L-蛋氨酸的合成。

但是，关键酶在高浓度底物甲硫醇钠环境下稳定性差，且蛋白质工程领域长期存在的“活性-稳定性权衡”问题，进一步导致其适应性改造困难。为突破这一困境，研究团队创新性提出 “动态网络刚性化-局部柔性调控” 策略，结合共识序列分析与结构导向设计，精准锚定突变热点，实现酶活与稳定性的协同提升。

【SynBioCon】获悉，近日，郑裕国院士团队汤晓玲、柳志强教授在AIChE Journal期刊上发表了题为《Structure-based engineering of O-succinyl-L-homoserine mercaptotransferase with improved substrate tolerance》的研究论文，原文链接：http://doi.org/10.1002/aic.70059

共识序列分析：锁定进化保守性突变位点

以前期筛选获得的具有工业应用潜力的Chromobacterium violaceum来源酶（CvMetZ）为研究对象， 通过多序列比对，分析氨基酸保守性分布与自由能变化（ΔΔG < -1 kcal/mol），最终锚定 20 个潜在突变位点，覆盖底物结合口袋、二聚体界面及催化核心区域，获得了有益突变体T59I和A241T，在5%甲硫醇钠浓度下，T59I的半衰期从野生型的3.3小时提升至9.8小时，酶活提升28%；A241T 则将半衰期延长至11.2小时，酶活提升25%。

图1 热点氨基酸残基的计算机筛选

结构导向设计：调控局部柔性增强稳定性

利用 AlphaFold v2.0 预测CvMetZ三维结构，结合分子对接与100 ns分子动力学模拟，发现酶分子的F115-G130 环区（位于底物结合口袋入口附近）柔性过高，是影响稳定性的关键区域。通过对该区域低保守性残基（S117、T118、T119等）进行饱和突变筛选，获得最优突变体T119Y，在5%甲硫醇钠条件下，半衰期提3.3倍，达10.8小时。

图2 基于序列比对分析和分子动力学模拟的保守环区确定迭代组合突变：实现性能进一步提升

将上述优势单点突变进行组合，构建双突变体（T59I/T119Y、T59I/A241T、T119Y/A241T）与三突变体（T59I/T119Y/A241T）。其中三突变体在5%甲硫醇钠浓度下的半衰期提升至20.6小时，酶活提升36%。分子动力学模拟进一步揭示，三突变体通过多重机制增强稳定性：T59I 强化疏水核心packing，A241T形成跨链氢键约束构象，T119Y稳定关键环区，三者协同使酶分子自由能景观更集中，低能量构象占比显著提升，实现 “刚性化网络 + 局部柔性调控” 的设计目标。

表1 CvMetZ及其突变体在不同甲硫醇钠浓度下的半衰期及酶活

为进一步适配工业化生产，将改造后的酶进行固定化研究，筛选了LX-1000EPN 环氧树脂作为固定化载体，固定化效率与活性回收率最高，优化了固定化和反应条件，固定化酶用于L -蛋氨酸合成时，前10批次活性保持 90% 以上，30 批次后仍保留 60% 以上活性，显著降低生产成本。

此外，通过放大实验验证了发酵酶法合成L-蛋氨酸的应用潜力：以 100 g/L以上O -琥珀酰- L -高丝氨酸为底物，以突变后的CvMetZ为生物催化剂，合成L -蛋氨酸得率达92.8%，为规模化生产提供了关键数据支撑。

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