檀香精油，源于檀香木心材，以其深邃、温暖、持久的独特木香气，被誉为“液体黄金”，位列世界最顶级的天然香料之一。其核心价值成分檀香醇在香水、化妆品、医药和宗教仪式中需求巨大。然而，檀香木生长缓慢（需数十年成材），资源稀缺且过度采伐导致价格极其昂贵（市场价约2500美元/公斤），供应极不稳定。利用合成生物学构建微生物“芳香本草细胞”，实现檀香精油等香精香料的可持续、规模化发酵生产，是解决资源瓶颈、保障稳定供应的理想途径，前期该研究团队成功创建的“玫瑰精油酵母”已经进入产业化阶段。

【SynBioCon】获悉，近日，中国科学院天津工业生物技术研究所戴住波、张学礼研究团队在《Journal of Agricultural and Food Chemistry》上发表重要研究成果。该研究运用亚细胞区室工程策略，聚焦于过氧化物酶体（Peroxisome）的改造与利用，开发P450酶过氧化物酶体表面展示技术，解决了该途径中细胞色素P450酶的催化瓶颈，成功构建了高效生产檀香醇的酵母细胞工厂，创造了目前文献报道的最高产量记录（10.4 g/L），为檀香精油的绿色、低成本生物制造奠定了坚实基础。

核心突破：450酶过氧化物酶体表面展示技术

1.P450酶催化效率瓶颈：研究团队首先通过模块化工程（筛选P450-CPR融合蛋白、优化基因拷贝数）初步构建了檀香醇合成途径。然而，产量仅停留在百毫克/升级别。为提高乙酰辅酶A（萜类合成关键前体）和还原力（NADPH）供应，团队将整个甲羟戊酸（MVA）途径及檀香烯/檀香醇合成关键酶，利用高效的过氧化物酶体靶向信号肽（ePTS1）定位到富含乙酰辅酶A的过氧化物酶体中（图2）。这虽然显著提升了总中间体（檀香烯）和檀香醇的产量，但关键P450酶（SaCYP736A167–46tATR1）与底物檀香烯的空间分隔问题凸显，导致底物向檀香醇的转化效率大幅降低（从90.9%降至31.0%）。

图2 过氧化物酶体工程生产檀香精油

2.过氧化物酶体表面展示技术：定位分析发现，带有ePTS1标签的关键P450融合酶并未成功定位在过氧化物酶体或内质网，而是错误地分散在细胞质中。这主要是由于其固有的N端跨膜结构域与C端过氧化物酶体基质定位信号（ePTS1）存在冲突。基于植物P450更倾向于锚定在内质网膜上，研究团队创造性地提出解决方案：将P450融合酶靶向定位到过氧化物酶体的表面膜上。他们利用过氧化物酶体膜蛋白Pex15的C端68个氨基酸片段（具有膜锚定功能）构建融合蛋白（SaA167–46tATR1-PEX15）。荧光共定位实验（图3A）证实，该策略成功地将P450酶展示在过氧化物酶体表面。为进一步提高定位效率，团队还截短了P450酶自身冗余的N端跨膜域（24tSaA167–46tATR1-PEX15）。这一“过氧化物酶体表面展示”策略（图3B）显著改善了酶与底物的接近度，将檀香醇和檀香烯的总产量提高至1.3g/L水平，檀香醇的转化率提升至36.2%。

图3 酵母过氧化物酶体表面展示技术提高檀香醇产量及转化率

3.过氧化物酶体表型重塑：野生型酵母通常只含有2-3个过氧化物酶体。研究团队通过过表达调控过氧化物酶体增殖的关键基因PEX11，成功诱导工程菌产生更多数量的过氧化物酶体（图4A）。这不仅增加了储存乙酰辅酶A的“工厂”数量，更重要的是极大地扩展了可供P450融合酶锚定的膜表面积。这一策略使得檀香醇产量进一步跃升42.6%，转化率大幅提升至惊人的60.6%！

图4 调控过氧化物酶体数量提高檀香醇的产量和转化率

4.工艺放大与优化：将优化后的菌株（PEX1511）在5L发酵罐中进行两阶段补料发酵（第一阶段快速生长，第二阶段诱导生产并结合原位萃取）。为进一步提升工业化潜力，团队还引入了组合优化策略（表达细菌血红蛋白VHb提升氧传递、过表达转录因子INO2扩大内质网空间以利于相关蛋白表达、利用突变体PDR3Q763L增强产物转运效率）。

最终，工程菌株PEX1511-VIP-R在168小时发酵后，实现了13.1 g/L 檀香烯和10.4 g/L 檀香醇的创纪录产量（图5），转化率达44.2%。经测算，该工艺下生产檀香精油的碳源成本将低于100美元/公斤，远低于2500美元/公斤的市场价格。

图5 高密度发酵生产檀香精油

意义与前景

在天然宿主中，复杂天然产物的生物合成和存储存在跨越多种类型亚细胞区室（如线粒体、内质网、脂滴、液泡等）的特征，甚至还存在跨越不同组织器官的特征。例如紫杉醇、甾体激素等天然产物的生物合成过程中，其酶、辅因子和中间体等常常具有区室分布的特征。该团队前期已将脂滴亚细胞区室工程应用于复杂天然产物人参皂苷的异源生物合成，实现人参皂苷CK的高效合成（YS Shi, Metab.Eng.,2021）。

本项目证明了过氧化物酶体亚细胞区室工程（包括基质靶向、酶表面展示和增殖调控）在合成高附加值天然产物（尤其是涉及P450催化的复杂萜类）方面具有巨大潜力。檀香精油生产成本的大幅降低（<100美元/kg（碳源成本）vs 2500美元/kg），为檀香精油的可持续微生物发酵生产铺平了道路，有望改变其依赖稀缺植物资源的传统供应链模式，保护濒危檀香木资源。

研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、海河实验室合成生物学创新基金等项目的支持。相关技术已申请专利。天津工生所王冬高级工程师为论文第一作者，戴住波研究员和张学礼为研究员共同通讯作者。

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