化石能源的使用与开发带动了现代工业蓬勃发展，但同时排放了大量二氧化碳（CO₂），加剧温室效应，造成全球变暖等气候问题。CO₂、CO和CH₄等同属于一碳气体，主要源于化石燃料的不完全燃烧，如生物质气化、生活废气和冶炼等重工业生产的尾气。据《BP世界能源展望》2024年版报道，2020年到2024年间，全球年均CO₂排放量超过400亿吨，预计2030年全球碳排放量达到峰值。近几年，随着我国“双碳”战略的提出，绿色低碳技术的创新和发展成为当今热门的话题与方向。

目前，传统生物炼制技术（以玉米、小麦等粮食作物或以木质纤维素为原料）存在原料利用效率低、成本高及土地利用变化导致的碳债问题。与之相比，“第三代生物炼制”路线愈加受到重视。该技术旨在构建微生物细胞工厂，利用光能、电能和化学能等可再生能源，将大气中的CO₂转化为燃料及化学品。该技术反应条件温和，产物选择性高，并能够实现碳固定与碳转化的同步进行。

迄今为止，第三代生物炼制技术取得重要进展，超过10种自然及人工合成的碳固定途径得到验证，部分CO₂固定技术已成功实现商业化（图1）。2016年，全球首套4.5×10⁴t/a钢铁工业尾气生物发酵制燃料乙醇商业化项目在河北省唐山市曹妃甸首钢京唐公司开工建设。项目投产后，每年可为企业减少约17×10⁴t CO₂排放。2021年，全球首套利用铁合金工业尾气制燃料乙醇项目在宁夏平罗县正式投产，项目每年降低CO₂排放量约18×10⁴t，年产燃料乙醇4.5×10⁴t，蛋白粉5000t。上述例子采用了第三代生物炼制技术，该技术利用化能自养微生物作为细胞工厂，实现了乙醇和蛋白饲料等产品的商业化生产。

自养微生物依据其能量来源可以分为化能自养微生物和光合自养微生物。尽管它们具备使用CO₂作为唯一碳源的能力，但通常生长速度较慢，碳固定效率较低，从而限制了它们合成产物的能力。为了实现CO₂的高效利用，研究者们开发适用于自养微生物的合成生物学工具，如建立CRISPR基因编辑工具或关键元件的定向进化等，利用基因编辑手段对自养微生物进行改造以实现对目标产物的高效合成。此外，相较于自养微生物，异养微生物基因编辑工具的研究更为系统，对“异养菌”进行“自养化”改造可以用于更多种类产品的生物合成。例如，大肠杆菌和毕赤酵母已经成功实现自养化改造，并通过基因编辑在毕赤酵母中实现了以CO₂为原料的乙酸生物合成。同样，CH₄与CO等其他一碳气体的生物转化也取得一些进展，部分成果成功商业化。

本文汇总了当前CO₂为原料的第三代生物炼制的最新研究进展，总结了已验证的自然及人工固碳途径，并分析了其在生物炼制的应用潜力。此外，结合实际案例，本文还探讨了目前固碳微生物工程化改造技术。

早在1970年代，石油危机推动了生物燃料的研究与产业化。石油供应的限制和价格上涨促使各国和地区，特别是巴西、美国和欧洲，开始关注替代能源的开发。以巴西为例，政府为减轻石油进口的依赖，于1975年起实施乙醇代替汽油的计划，利用本国丰富的甘蔗资源生产生物乙醇。1982年，“生物炼制”的概念首次被提出，随着化石能源的过度使用，能源、资源和环境问题日趋严峻，越来越多的国家将生物炼制技术作为战略性研究方向。1990年代，基于“生物炼制工厂”概念的多产品模式成为研究热点。1998年，美国通过《生物质能源和生物基产品研究发展法案》，推动了通过细胞工厂将生物质转化为乙醇等生物燃料的研究和生产。此外，随着农业技术的进步，玉米等原料的产量增加，为生物燃料的工业化提供了一定的资源供应。

以玉米、油料作物等可再生生物质为原料的“第一代”生物炼制技术，有助于减少化石燃料的使用以及CO₂的排放，并改善能源安全。但人们对原料的来源存在担忧，包括对生物多样性、土地利用变化以及与粮食作物的竞争等问题。这种担忧限制了第一代生物燃料的生产，此外，曾有研究指出，生物柴油不是一种具有成本效益的减排技术。因此，迫切需要开发一种廉价且非食品的材料作为原料生产燃料和化学品。木质纤维素原料具有转化为新型生物燃料的能力，即“第二代”生物燃料。木质纤维素类生物质包括木材、农业秸秆及其加工废弃物，作为地球上最丰富且未被充分利用的生物资源之一，已被广泛认可为一种具有潜力的能源和原料来源。从基础层面分析，植物生物质可通过直接燃烧转化为热能及电能。然而，在液体生物燃料的生产中，植物生物质展现出更为显著的潜力。这一转化过程不仅能够提高能源的利用效率，还有助于减少对化石燃料的依赖，从而在可再生能源领域中占据重要地位。但目前植物生物质的利用还存在许多技术障碍，如木质纤维素结构的复杂性极大地限制了其在实际生产中的应用。第二代生物炼制技术虽然在理论上提供了一种将木质纤维素生物质转化为能源和化学品的途径，但在实际应用中面临高成本、高能耗水耗、环境影响以及技术成熟度不足等问题，导致其经济可行性受限。因此，开发第三代生物炼制技术显得尤为必要。

第三代生物炼制技术通过利用CO₂和H₂、光能等可再生能源作为碳源和能量来源，旨在实现可持续、成本效益更高、环境友好的生产过程，该技术不仅能够克服第二代技术的局限，还能推动相关技术创新，为生物制造领域带来新的突破。与前两代生物炼制技术的原料相比，CO₂作为底物不仅更加丰富廉价，同时可以减少大气中CO₂的含量，从而缓解温室效应。因此，第三代生物炼制技术被认为是缓解化石能源枯竭和温室效应的有效途径之一。通过该技术可生产甲酸、甲醇等C₁化学品；也可以进一步延伸碳链，生产多元醇、酸及生物基聚合物等高附加值产品。

进入21世纪，第三代生物炼制技术取得了显著进展，尤其是在基因编辑、发酵培养、油脂提取和生物燃料转化技术方面，生产效率得到了大幅提升。例如，利用光生物反应器培养微藻，单位面积产量提高了20~30倍。在用于第三代生物炼制的各类细胞工厂中，不同微生物的生产能力和转化效率因种类和工程策略的不同而有所差异。

例如，经代谢工程改造的酿酒酵母可实现利用CO₂高效合成脂肪酸乙酯，其产量可达50~70g/L，而工程大肠杆菌同样能够合成30~50g/L的脂肪酸乙酯，并可进一步精炼为生物柴油。除了利用单一细胞工厂进行生物炼制外，细胞共培养系统的开发使得碳转化率进一步提升。例如，在微藻-大肠杆菌共培养系统中可实现更高效的碳循环，CO₂的转化效率提升至35%~40%，该系统的脂肪酸等产物的产率比单一微生物培养提高约20%。

3HP/4HB途径起始于乙酰辅酶A，经乙酰辅酶A羧化酶羧化，生成丙二酰辅酶A；接着，丙二酰辅酶A在丙二酰辅酶A还原酶的作用下还原为丙醛酸半醛，并进一步还原为3-羟基丙酸（3HP）；3HP进一步还原为丙酰辅酶A，随后在羧化酶的催化下生成甲基丙二酰辅酶A并进一步转化为琥珀酰辅酶A；琥珀酰辅酶A在琥珀酰辅酶A还原酶的作用下还原为琥珀酸半醛，进而在琥珀酸半醛还原酶的作用下还原为4-羟基丁酸（4HB）；4-羟基丁酸在4-羟基丁酰辅酶A合酶的作用下转化为4-羟基丁酰辅酶A，并通过4-羟基丁酰辅酶A脱水酶的作用生成巴豆酰辅酶A；巴豆酰辅酶A在巴豆酰辅酶A水合酶的作用下水合为(S)-3-羟基丁酰辅酶A；最终，(S)-3-羟基丁酰辅酶A在(S)-3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶的作用下氧化为乙酰辅酶A。

通过这个循环，一个乙酰辅酶A和两分子碳酸氢盐最终转化为两个乙酰辅酶A分子，实现了二氧化碳的固定和有机物质的合成。这个循环在能量效率和酶的催化效率方面与其他已知的二氧化碳固定途径有所不同，对于理解古菌在地球碳循环中的作用具有重要意义。

在C. aurantiacus中，3-HP双循环不仅适合于自养生长中的二氧化碳固定，还适合于同化各种有机底物，如甘氨酸、乙酸、丙酸、3-羟基丙酸、乳酸、丁酸或琥珀酸。这些有机底物通过3-HP双循环和乙二醇酸循环一起被导入中心碳代谢。当细胞以这些有机底物为唯一碳源异养生长时，3-HP双循环中的酶活性仅受到轻微影响。这表明C. aurantiacus能够利用3-HP双循环迅速同化多种有机酸，并且这些有机酸可以作为碳源被细胞利用。

总结来说，3-HP双循环是一个复杂而高效的代谢途径，它不仅能够固定二氧化碳，还能够将多种有机底物整合到中心碳代谢中，为C. aurantiacus提供了一种灵活的碳利用策略。

在Liu等的研究中，对不同固碳途径的优劣性进行了详尽的分析，涵盖了能量来源、底物与产物的种类、关键酶的类型及其活性等多个维度。该研究特别强调了固碳途径在实际应用时需考虑的关键因素，包括氧气敏感性、ATP的需求、热力学限制、酶动力学特性以及CO₂的利用方式。这些因素对于提高固碳效率和优化生物炼制过程具有重要的指导意义。在氧气的存在下是否具有代谢能力，是区分不同固碳途径的重要因素之一。例如，WLP中的CO脱氢酶、氢化酶以及电子载体铁氧还蛋白所具有的Fe-S簇对氧气十分敏感，因此该途径只能在严格厌氧的环境下运行。相比之下，卡尔文循环、还原甘氨酸途径等可以在有氧条件下进行。

第三代生物炼制中，能量供给是一个关键问题。

不同固碳途径对其ATP的需求不同。在好氧代谢途径中，呼吸链通常需要大量的还原力来提供ATP，从而减少对CO₂的还原力供应。而在厌氧代谢途径中，厌氧生物因其ATP产率低，生长速率低，生物质积累少而导致难以产生能量密集的产品。ATP在不同代谢途径中的需求，主要源自还原当量和电子供体。在生物化学反应中，铁氧还蛋白（铁氧还蛋白的氧化还原电势E₀^'为-450mV）相较于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH，氧化还原电势为-320mV）或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH，氧化还原电势-320mV），能够提供更高的能量驱动力。因此，将NAD(P)H替换为两种铁氧还蛋白作为电子供体，可以额外提供大约20kJ/mol的能量驱动力，从而增强反应的热力学可行性。同时，电子受体是CO₂还是碳酸氢根也会影响微生物对碳的利用。CO₂在与空气其他组分（1atm，1atm=101.325kPa，20℃）平衡时，其在水中（pH=7.4）的溶解浓度仅为0.012mmol/L，而CO₂以碳酸氢盐的形式存在时，其在水中（pH=7.4，20℃）的溶解度为0.26mmol/L。因此，使用碳酸氢盐为碳源的反应比使用二氧化碳更加有效。

3.2.1  食气梭菌

以食气梭菌为代表的产乙酸细菌（acetogens）属于常见的化能自养微生物，可以利用WLP固定CO₂进行自养生长，在维持细胞生长的同时合成乙酸、乙醇、乳酸和2,3-丁二醇等。食气梭菌在利用CO₂营自养生长时，需要H₂或CO作为电子供体提供还原力，由于H₂及CO在水中的溶解度极低（H₂饱和浓度为7.1×10^-4mol/L，37℃，100kPa；CO饱和浓度为8.2×10^-4mol/L，37℃，100kPa），细胞在利用CO或H₂受到气液间传质上的限制，从而限制梭菌的生长及产量。此外，食气梭菌在利用CO₂产乙酸过程中容易受到电子匮乏等问题导致产率降低，产1mol乙酸仅能生产0.25~0.35mol ATP。Emerson等在永达尔梭菌利用CO₂和H₂作为碳源和能源时，额外添加硝酸盐作为电子受体，从而提高了细胞生长速率及ATP/ADP比值。为提高食气梭菌利用电子的效率，Haas等报道了一种气体扩散电极，可增强CO₂与电极之间的相互作用，利用电解槽的电能协助梭菌发酵生产乙酸和乙醇。在提高细菌对气体组分摄取能力的同时，优化细菌培养基的组分能影响菌体的产率。Sun等在对拉格斯代尔梭菌（Clostridium ragsdalei）的连续发酵中发现，将培养基中的酵母提取物替换为棉花籽提取物时，可明显提高乙醇的产量。另外，pH与温度的改变都会影响食气梭菌产物的积累，通过优化菌株的生长条件与状况，可以实现产物的理性调控。Heffernan等研究表明，在CO₂中添加少量CO共利用，使得产乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum）的固碳能力从460mmol CO2/(gDCW·d)提升至540mmol CO₂/(gDCW·d)，且固定的碳主要分布在乙醇中。

除了对发酵工艺的优化之外，通过代谢工程改造食气梭菌等产乙酸菌，以实现目标产物的理性合成，也成为目前研究的热点。Straub等在伍氏醋酸杆菌（Acetobacterium woodii）中表达了来自永达尔梭菌（Clostridium ljungdahlii）的磷酸转乙酰酶（phosphotransacetylase，PTA）及乙酸激酶（acetate kinase，ACK），从而使其在CO₂发酵中乙酸产量提高到50g/L；在永达尔梭菌中，通过双敲除醇/醛脱氢酶后，乙酸的产率可达到原先的2.7倍；Cheng等在食一氧化碳梭菌（Clostridium carboxidivorans）过表达了醇/醛脱氢酶及fnr两个基因后，丁醇产量提高了22%。

食气梭菌展现了其在不同产物合成中的巨大潜力，Lanza Tech、Synata Bio和巨鹏生物等几家公司已经利用食气梭菌作为合成生物学平台，并实现部分产品的商业化生产。Lanza Tech使用改造后的C. autoethanogenum，通过吸收工业废气（含CO和CO₂）生成乙醇和其他化学品，这种工艺已在钢铁厂实现应用，减少了CO₂排放，并副产菌体蛋白。2024年11月，北京首钢朗泽科技股份有限公司（以下简称“首钢朗泽”）利用首钢京唐的焦炉煤气和转炉煤气（富含CO₂）作为原料，通过气体预处理、发酵、蒸馏脱水等工艺流程，生产无水乙醇和新型饲料蛋白。该技术每生产1t乙醇可直接消耗约0.5t CO₂，项目建成投产后预计每年可生产无水乙醇1.5×10⁴t、蛋白饲料750t，预计年销售收入1.2亿元。类似地，Evonik与西门子合作开发的Rheticus项目结合了电解和发酵技术，利用特定菌株在发酵罐中转化CO₂和H₂，生产化学中间体丙酸和丁酸。Rheticus项目于2021年投产，年产能为2×10⁴t，这些产品可进一步加工为多种精细化学品和生物材料。该领域方向具有较好的经济性和较低的碳排放，有望在生物基化工领域进一步扩展。

3.2.2  古菌

古菌的基因组结构不同于细菌和真核生物，因而传统的基因编辑技术（如CRISPR/Cas系统）在古菌中的应用相对受限。然而，科研人员逐步优化了CRISPR/Cas9和Cas12a等系统，以适用于古菌中的基因编辑。例如，已在产甲烷古菌（如Methanosarcina acetivorans）中成功应用CRISPR/Cas9系统调控关键代谢基因，实现了CO₂的高效固定和甲烷生成。产甲烷古菌能够利用CO₂和氢气生成甲烷，是碳捕集与利用的良好生物平台，工程化改造甲烷古菌，优化其WLP的关键酶系，有助于提升其CO₂固定效率并提高甲烷产率。例如，通过调控甲基辅因子合成路径，Huber等在甲烷古菌中显著提高了甲烷产量。在工业化应用方面，这种利用CO₂生成甲烷的途径已被逐步应用于废气的资源化处理，并开发出多个小规模工业化装置用于实验性生产。

此外，一些工程化改造研究专注于古菌对底物（如CO₂、H₂等）的利用效率，使其在高温和厌氧条件下生产乙醇、丙酸等有机物，开辟了将古菌用于多样化化学品生产的新途径。综上所述，古菌在极端条件下的代谢活性和工程化改造的可行性为第三代生物炼制提供了新的平台。未来，古菌的基因编辑和代谢优化工具将进一步完善，助力其在可持续燃料和化学品生产中的应用。

3.2.3  蓝细菌

蓝细菌又称蓝藻，是一种具光合自养能力的微生物，能够直接利用光能和CO₂进行代谢。蓝细菌可以利用羧酶体增加胞内CO₂浓度，进而提高CBB循环的固碳效率。作为重要的微生物细胞工厂，蓝细菌因其高效的CO₂固定能力和丰富的代谢产物而备受关注。通过基因编辑技术，敲除竞争性代谢途径中的碳流分配关键酶，显著提升了蓝细菌的乙醇和异戊二烯产量。Lee等引入蜡酯合成酶，首次实现了蓝细菌异源合成脂肪酸乙酯。Lai等将梭菌的WL途径引入到蓝细菌中，实现了丁酸的高效合成。

除了直接改造目标产物途径，强化蓝细菌对光能的有效利用，增强CO₂固定效率也是目前的研究热点。通过基因改造增强蓝细菌的光吸收系统和Rubisco酶活性，Li等有效提高了其CO₂固定速率和碳流动性。将Rubisco酶的表达量增加并优化其催化活性，可以显著提高光合作用效率，增加碳源流向目标代谢产物。Nürnberg等确定了叶绿素f为远红外线生长情况下蓝细菌的光系统复合物。叶绿素f的发现有望拓宽蓝细菌对光能的利用。在耐受性上，丝氨酸羟甲基酶被认为与细胞耐盐性直接相关，这些抗逆性增强措施为蓝细菌在大规模生产中的应用铺平了道路，并有助于降低培养成本。

3.2.4  微藻

微藻作为同样具有光合自养能力的微生物，可以利用光合作用固定CO₂的同时产生油脂等高附加值产品。相比于其他植物，微藻具有更高的光合效率，且对土地的占用远少于其他植物。据报道，生产1t微藻生物质的同时可以固定1.8t CO₂。微藻包括小球藻（Chlorella）、螺旋藻（Spirulina）以及其他绿藻。微拟球藻（Nannochloropsis）等富油微藻的藻类脂质通过与甲醇之间的酯交换反应被转化为生物柴油。此类微藻脂质具有丰富的不饱和脂肪酸，其转化后的生物柴油适应于低温工作环境。2006年，美国Green Fuel Technology公司在亚利桑那州建立了偶联1040MW电厂烟气的碳捕捉系统，采用Green Fuel 3D Matrix技术利用烟气中的CO₂大规模培育微藻，并将其转化为生物柴油。

近年来，合成生物学的发展拓宽了微藻产品的范围，其中多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）具有医疗、保健作用，成为目前利用微藻生物合成的热点领域之一。PUFAs中如前列腺素、白三烯等对维持人体免疫、心脑血管系统正常运作具有显著功效，但在人体合成速率极低，无法满足正常生理需求，因而需要在饮食或保健品中摄取。当前PUFAs主要来源为深海鱼类，然而过度捕捞及加工时大量的废弃物对生态环境造成严重破坏。相比于深海鱼类，微藻是天然的PUFAs生产者，具有持续生产微藻藻油的能力，且微藻藻油的不饱和脂肪酸纯度较高。Xin等通过对微球藻中2型二酰基甘油酰基转移酶的体外和体内活性进行系统分析，揭示了不同藻类生物合成的偏好性。通过合理调节共进化的2型二酰基甘油酰基转移酶转录水平，实现不同脂肪酸的理性合成。此外，利用合成生物学技术，微藻还可以用于疟疾疫苗等重组蛋白的生产。

3.3.1  优化能量供给增强CO₂固定

异养微生物通常以葡萄糖等有机物为原料合成化学品，其发酵过程通常伴随着CO₂的释放。然而，在异养微生物生产某些特定化学品的过程中，可以将释放的CO₂进行重吸收并用于目标化学品的合成。例如，酿酒酵母以葡萄糖为底物生产乙醇时，产生CO₂与NADH，多余的NADH可以用于CO₂固定。基于此，Guadaluge-Medina等将蓝细菌的磷酸核糖激酶基因（prk）和编码Rubisco酶亚基的基因（rbcLXS）导入酿酒酵母中，在中心碳代谢途径中构建了可以固定CO₂的卡尔文循环支路，并最终使得乙醇对底物的得率提高了10%。

为了使异养微生物能够固定更多的CO₂，可以在生物体内引入外源的能量供给系统。目前，已证明在异养微生物体内有效的能量供给系统包括人工电子通道、氢气利用系统、视紫红质光系统以及半导体纳米捕光系统。目前与异养微生物CO₂固定兼容性最好的能量捕获系统是半导体纳米捕光系统，例如，哈佛大学Joshi团队将半导体材料磷化铟颗粒组装到酿酒酵母细胞表面，酵母细胞利用表面的纳米颗粒获取光生电子，并将其用于NADPH的再生，高效合成莽草酸。近期，Hu等的一项研究报道了大肠杆菌组装硫化镉捕光系统，实现了光能驱动CO₂的固定，工程菌株苹果酸与丁酸产量分别提高到1.48mol/mol葡萄糖和0.79mol/mol葡萄糖。

3.3.2  强化CO₂羧化途径

3.3.3  引入异源CO₂固定途径

以CO₂为底物的第三代生物炼制技术，以其资源广泛性、环境友好性和产品多样性，为实现绿色制造和可持续发展提供了重要支撑。开发高效利用CO₂的细胞工厂将实现社会的低碳可持续发展，从而带来更大的经济，社会和环境效益。尽管第三代生物炼制技术在生物制造方面展现出了巨大潜力，但同时也存在一些局限性和挑战。诸如CO₂固定关键酶的催化效率低下，CO₂固定涉及多个代谢步骤，细胞定向调控难度较大。部分自养微生物需要大量的能量与还原力固定CO₂，对细胞正常生长造成负担。外源途径在宿主细胞内可能存在不兼容现象，从而对基因表达及其功能产生影响。在工业应用方面，绝大多数的固碳途径还是停留在“概念验证”阶段，技术指标未能达到规模化生物制造的需求。

因此，为了获取CO₂高效利用的细胞工厂，还需进行许多工作。这其中包括：①合成生物学的深度应用，通过优化基因组编辑、代谢网络构建及人工细胞设计技术，能够精准调控微生物代谢流量，提升目标产物的产率和选择性；②通过生物与化学催化的协同作用，实现C₁资源的高效转化，为工业化生产提供新路径；③结合代谢组学、蛋白组学等高通量技术结合机器学习算法，揭示微生物代谢机制，优化工程策略，提高生产效率；④针对不同C₁资源特点，开发规模化、低成本的发酵工艺，推动技术在燃料、生物材料和医药等领域的应用落地；⑤政策支持和市场激励也是推动这一技术发展的重要因素。

第三代生物炼制有望在CO₂资源循环利用、碳减排等方面发挥重要作用，为现代工业的绿色转型提供重要机遇，但其进一步发展仍需跨学科合作、技术创新和政策指导。未来，随着生物技术和工程技术的不断突破，第三代生物炼制将在能源、环境和材料领域释放更大的应用潜力，并为实现全球可持续发展目标提供有力支持。