[SynBioCon]获悉，近期，天津科技大学与中合基因等团队合作在《Chem & Bio Engineering》上发表了一项突破性成果，成功开发出一条绿色、可放大、高产率的化学-酶法级联路线，首次实现了嘌呤型3'-ONH₂-dATP和3'-ONH₂-dGTP的高效合成。更重要的是，该产物在酶促DNA合成应用中2表现优异，120nt单步准确率为99.7%。

为提高3'-ONH₂-dNTPs合成效率，研究团队设计了“化学修饰 + 酶促磷酸化”的级联策略：首先，在商业化dA和dG上引入氨基烷氧基，分别以24.9%和27.3%的收率获得3'-ONH₂-dA和3'-ONH₂-dG；其次，利用激酶实现修饰核苷磷酸化；最终，引入SmPPK2，建立ATP/3'-ONH₂-dATP再生循环，减少昂贵底物的初始投入量。

获得3'-ONH₂-dA和3'-ONH₂-dG为级联反应奠定了基础，然而，真正的挑战在于后续的磷酸化——天然激酶对带有大体积3'-ONH₂修饰的核苷“不认”，催化活性极低。为此，团队采用了结构指导的半理性设计策略，对两种关键磷酸化酶进行了精准的活性空腔改造。

针对3'-ONH₂-dG底物的位阻问题，团队对果蝇来源的脱氧核糖核苷激酶（Dm-dNK）活性口袋内的16个关键残基进行了定点饱和突变。其中，M88G突变将活性空腔体积从132 ų扩大至195 ų，使得3'-ONH₂-dG的单磷酸化转化率从野生型的26%飙升至97.8%——提升超过3倍。动力学分析进一步证实，M88G突变体的催化效率（k_cat/K_m）达2.178×10⁴ M⁻¹·s⁻¹，较野生型（1.955×10³ M⁻¹·s⁻¹）提升了逾10倍。200ns分子动力学模拟揭示，该突变通过减少位阻、增强底物与Glu52、Glu171等残基的氢键网络以及稳定与Phe80/Phe114的π-π堆积相互作用，显著提升了底物结合稳定性。

与Dm-dNK类似，MrPPK2对3'-ONH₂-dGMP也几乎无催化活性。通过对活性口袋内14个残基的饱和突变筛选，团队发现D127G突变是关键突破——该突变将天冬氨酸替换为甘氨酸，有效缓解了活性中心的位阻。突变体实现了3'-ONH₂-dGMP向三磷酸形式59.9%的转化率，而野生型几乎无活性。动力学数据显示，D127G突变体对3'-ONH₂-dGMP的单磷酸化催化效率达1.74×10⁶ M⁻¹·s⁻¹，双磷酸化（生成三磷酸）效率为1.16×10⁵ M⁻¹·s⁻¹。MD模拟表明，D127G突变增强了底物与Arg182、Lys191等残基的稳定氢键网络，整体结构稳定性显著提升。

团队将改造后的Dm-dNK（M88G）和MrPPK2（D127G）与SmPPK2（用于ATP/3'-ONH₂-dATP再生循环）整合，构建了一个三酶级联反应体系。该设计通过SmPPK2建立ATP和3'-ONH₂-dATP的再生循环，不仅降低了高能磷酸供体的初始投入成本，还减少了过量核苷酸杂质对后续分离纯化的干扰。在30 mL制备规模上，实现纯度3'-ONH₂-dATP和的3'-ONH₂-dGTP生产制备，产物结构经LC-MS、UPLC和NMR全方面验证，最终纯度分别为97%、85.1%。

更重要的是，自产修饰核苷酸在单核苷酸掺入和长链DNA合成方面均表现优异。这一功能验证充分证明，酶法合成的产物完全满足高保真酶促DNA合成的应用需求。- 单核苷酸掺入：使用16种不同引物链，比较自制产物与商业品在TdT催化下的掺入效率，PAGE结果显示两者无差异。- 120 nt长链合成：用自制3'-ONH₂-dATP/dGTP替换商业品，合成120个核苷酸的单链DNA，单步准确率为99.70%，对照组为99.69%，无统计学差异。

这是首次报道嘌呤型3'-ONH₂-dNTPs的化学-酶法合成。与传统化学磷酸化路线相比，本方法具有三大显著优势：

1，绿色环保：摒弃了磷酰氯、三苯基膦等有毒试剂，大幅减少含磷和有机废弃物（传统方法每克产品产生数百克废物）；

2，步骤精简：无需繁琐的保护-脱保护操作，一锅法级联反应大幅简化工艺流程；3，可放大生产：30 mL规模的制备验证证明了该路线的工业化潜力。

该策略为酶促DNA合成关键原料修饰核苷酸的规模化制备提供了一种绿色、可放大的替代方案，有望解决化学法合成原料产量低、成本高的瓶颈问题，也为DNA数据存储、基因合成和精准医疗等下游技术扫清了原料供应障碍，助力相关技术及产品的快速推广应用。
来源：中合基因

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