丙烯酸（Acrylic Acid）, 这个名字或许不够"出圈"，但它的下游产品几乎包围了我们的日常生活：婴儿纸尿裤中的高吸水性树脂（SAP）、建筑涂料、胶粘剂、纺织品整理剂……2025年全球丙烯酸市场需求已逼近900万吨，预计2030年将突破1041万吨，市场规模超过96亿美元。

然而，如此庞大的产业至今仍几乎完全绑定在化石基原料之上。工业上，丙烯酸主要通过丙烯（石油衍生品）的两步催化氧化法生产——不仅依赖不可再生资源，还伴随高能耗、大量CO₂排放以及有毒副产物（如丙烯醛）的生成。

生物合成路线理论上更绿色，但现实十分骨感。此前报道的5条微生物合成路径（甘油途径、丙二酰-CoA途径、β-丙氨酸途径等）普遍面临三大死结：路径冗长（需要3-5步酶促反应）、辅因子依赖严重（如昂贵的维生素B12）、以及最致命的——丙烯酸本身对微生物细胞具有极强的毒性。这导致现有活体细胞（in vivo）路线的产量长期卡在毫克级别，转化率甚至低于3%。

与其在活细胞里"戴着镣铐跳舞"，不如跳出碳基生命的限制，从底层酶催化机制出发，打造一条全新的体外无细胞（Cell-free）生物合成路线。

[SynBioCon] 获悉，7月21日，中国科学院天津工业生物技术研究所江会锋研究员、刘玉万研究员和盛翔研究员团队联合中国科学技术大学等机构在《自然·通讯》发表了题为“Towards an enzyme cascade synthesis of the bulk chemical acrylic acid”的研究论文，他们通过挖掘和改造ThDP依赖酶并结合体外多酶级联路径，将甲醇转化为丙烯酸，产量达到4.3克/升，转化率高达99.5%。

01

团队与核心策略：为什么是ThDP依赖酶？

江会锋团队长期深耕新酶设计与一碳生物合成领域，此前已在乙酰辅酶A的一碳合成途径设计方面取得重要突破。这一次，他们将目光投向了一个更"大胆"的目标——让酶催化一个自然界中不存在的反应。

有机化学中，H₂PO₄⁻是一个良好的离去基团，可以在特定条件下发生消除反应生成双键。受此启发，团队提出了一个极为精巧的设计思路：

能否找到一种酶，催化磷酸二羟丙酮（DHAP）直接消除H₂PO₄⁻，一步生成丙烯酸？

他们锁定了一类名为硫胺素二磷酸（ThDP）依赖性酶的蛋白家族。ThDP酶在自然界中擅长催化C-C键的形成与断裂，但从未被报道过能够催化磷酸消除反应。通过虚拟筛选，团队找到了一个活性最高的候选酶——ProThDP2，由此开启了"从0到1"的酶催化功能重塑之旅。

02

催化机制揭秘：四步"分子舞蹈"与22.9 kcal/mol的限速步骤

为了理解ProThDP2如何实现这一非天然反应，团队利用密度泛函理论（DFT）量子化学计算，对完整催化循环进行了原子级别的解析。

整个反应被拆解为四步精密的"分子舞蹈"：

第一步：异构化。DHAP在酶活性中心发生构型重排，转化为D-甘油醛-3-磷酸（D-G3P），为后续ThDP亲核进攻做好准备。

第二步：烯醇-ThDP中间体形成。ThDP的叶立德（ylide）形式进攻D-G3P的醛基碳，经过两次关键的质子转移——H120和E57被确认为介导这两次质子转移的核心氨基酸残基——生成稳定的烯醇-ThDP共价中间体（Int7）。

第三步：H₂PO₄⁻消除（限速步）。在烯醇-ThDP构象下，C-O键发生断裂，H₂PO₄⁻作为离去基团被直接消除，生成丙烯酰-ThDP。DFT计算表明，这一步C-C键断裂的能垒为22.9 kcal/mol（对应过渡态TS10），是整个催化循环的限速步骤。

第四步：水解。丙烯酰-ThDP水解释放丙烯酸，酶恢复初始状态，进入下一轮催化循环。

这一机制的阐明，相当于为后续的理性改造提供了一张精确到每个氨基酸残基的"分子地图"。

03

定向进化的"新武器"：ADE-OPI-MS全自动高通量筛选

天然ProThDP2的催化效率远不能满足工业级应用。团队祭出了合成生物学领域的一项前沿装备——基于声波液滴喷射-开放端口接口质谱（ADE-OPI-MS）的全自动高通量筛选平台。

传统的酶定向进化受限于人工操作，通量低、周期长。而该自动化平台将"构建-测试-学习"的循环速度提升了一个数量级。经过多轮深度改造，团队从庞大的突变体库中筛选出超级突变体ProThDP2-M4，并正式将其命名为丙烯酸合酶（Acrylic Acid Synthase, AAS）。

AAS的k_cat/K_m值比野生型高了13.6倍，结构分析显示D424R、P8C和G176R这三个远端突变通过引入新的盐桥和氢键让蛋白的熔解温度提升了12摄氏度，T492G突变可能减小了底物进出通道的空间位阻。

有了核心催化剂AAS，团队搭建了完整的甲醇制丙烯酸（MAAP）体外多酶级联途径，分为两个模块：

模块一：甲醇 → 二羟基丙酮（DHA）

●   醇氧化酶（AOX）将甲醇氧化为甲醛，同时由过氧化氢酶（CAT）解毒副产物H₂O₂

●   工程化甲醛裂合酶（FLS-M3）将甲醛缩合为二羟基丙酮（DHA）

模块二：DHA → 丙烯酸（AA）

●   多聚磷酸激酶（PPK）实现ATP的高效再生（以廉价的多聚磷酸钠为底物）

●   二羟基丙酮激酶（DAK）利用ATP将DHA磷酸化为DHAP

●   核心人工酶AAS催化DHAP直接消除H₂PO₄⁻，生成丙烯酸

在工艺优化中，团队发现了一个关键瓶颈：丙烯酸自身的酸性会随反应进行导致pH下降，严重抑制AAS活性。通过引入KOH精准调控pH值，成功打通了这一障碍:

16小时的单锅分步反应中，180 mM甲醇被高效转化，丙烯酸滴度高达4.3 g/L，转化率达到惊人的99.5%，生产强度达268.9 mg/L/h（比已知文献报道高出34-448倍）！

04

成本分析与前景

从实验室到工厂，成本是绕不开的话题。文章表示：

●   原料成本优势： 采用“绿色甲醇”作为碳源（当前成本约200-400 USD/吨）。按文章测算，生产1吨丙烯酸仅需约1.34吨甲醇，碳源成本仅为268美元/吨，极具成本竞争力。

●   绕开毒性瓶颈，突破产能天花板： 传统微生物发酵（in vivo）极难克服丙烯酸的细胞毒性，产量极具上限。本项目采用无细胞生物制造（Cell-free Biomanufacturing）体系，完美规避了宿主毒性问题，是剧毒化学品生物合成的教科书级解决方案。

●   综合成本模型： 结合廉价甲醇、多聚磷酸钠主导的ATP再生（约1050 USD/吨）、产物分离（约55 USD/吨），在未来高密度发酵量产酶及固定化酶技术的加持下，总体生产成本有望控制在1600 USD/吨以下，完全有实力与目前1200-2420 USD/吨的市场售价在商业上一较高下。

当然，这项研究距离真正的工业化还有几道坎要过：

1.辅酶再生的"经济账"仍是最大短板。目前依赖化学法（六偏磷酸钠）进行ATP再生，占据了总成本的最大板块。未来亟需开发基于光驱动或电驱动的低成本辅酶再生系统，才能从根本上提升经济可行性。

2. 酶的工程寿命。体外多酶体系中的酶无法像活细胞那样自我修复和更新。需要通过固定化酶技术提升AAS及整个级联酶系的半衰期和重复使用批次。

3. 体内-体外双轨并行。文章特别提到，若通过进一步蛋白质工程（如突变体AAS-D301S）消除副产物生成能力，并结合高耐受底盘细胞的改造，未来该通路有潜力被重新植入工业微生物中——实现"体内+体外"双轨并行的制造蓝图。

来源：https://doi.org/10.1038/s41467-026-75484-w

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