SynBio团队| 浙江工业大学柳志强教授

1,4-丁二醇（1，4-Butanediol，BDO）是一种重要的四碳二元醇化合物，作为关键化工原料，广泛用于合成γ-丁内酯、四氢呋喃等化学品，尤其在生物可降解塑料领域应用突出。目前BDO主要通过石油化工途径（如Reppe法等）生产，但随着生物技术发展，利用微生物细胞工厂合成高价值化学品已受到越来越多的关注。

然而，BDO生物合成仍面临三大核心挑战：缺乏天然产BDO的微生物；合成途径中碳损失严重；对抗生素和诱导剂依赖大，成本高。

【SynBioCon】获悉，针对上述问题，浙江工业大学的柳志强等人通过系统化代谢工程改造大肠杆菌，构建了无抗生素、无诱导剂的BDO高效合成菌株，其研究成果以论文形式发表于《Chemical Engineering Journal》，题为“Sustainable antibiotic-free high-yield 1,4-butanediol production by engineered aldehyde dehydrogenase and carbon flux remodeling in Escherichia coli”。

作者首先选择的策略是引入BDO异源合成途径以及优化关键酶。作者将四个酶基因导入菌株后，底盘细胞成功产出0.1 g/L的BDO。同时，作者对不同来源的酶的活性进行筛选，最终确定源自牙龈卟啉单胞菌的Pg_sucD、Pg_cat2，克氏梭菌的Ck_4hbD，以及拜氏梭菌的Cb_ald以及大肠杆菌内源醇脱氢酶Ec_yqhD为最优酶组合。携带该组合基因的菌株，其摇瓶内滴度达到0.82 g/L。作者还针对BDO合成中的关键醛脱氢酶Ald做了突变筛选，获得最优突变体Ald(M227V)，该突变体通过扩大酶的疏水活性口袋增强了对底物的亲和力，使 BDO产量提升11.19倍。

在发酵过程中，实验发现出现丙酮酸（BDO的合成前体）的大量积累，转化效率低导致碳损失。因此，作者敲除了pdhR基因（编码转录抑制因子），提高丙酮酸脱氢酶复合物（PDHc）活性，增强丙酮酸向乙酰辅酶A转化，显著降低了丙酮酸积累量。通过调节三羧酸循环中的关键酶的表达，优化菌株内TCA循环代谢通量，使BDO产量提升44%，达到 1.83 g/L。同时研究团队敲除了副产物合成相关酶基因，减少竞争性代谢途径，进一步提高BDO产量。

另外具有非常重要意义的一步，作者构建了不依赖于抗生素和诱导剂的发酵系统。他们复制了大肠杆菌内源转录调控元件，替代外源诱导剂驱动BDO合成基因表达。同时引入hok/sok毒素-抗毒素系统，将hok（编码细胞毒性蛋白）和sok（编码反义RNA，抑制hok表达）基因克隆到质粒中，该系统使菌株在无抗生素条件下连续发酵10批次后，BDO产量仍保持稳定。

最终，改造后的工程菌株B21-pT19在5 L反应器进行分批补料发酵72 h后实现34.63 g/L BDO产量，且全程无需添加抗生素和诱导剂，达到当前报道最高水平。

▌ 参考信息：本文部分素材来自《Chemical Engineering Journal》。由作者重新编写，系作者个人观点，本平台发布仅为了传达一种不同观点，不代表对该观点或支持。如果有任何问题，请联系我们：15381397601（微信同号）。